科研文献:牛胚胎低温储存延长办法研究,添加鱼抗冻蛋白可有效延长牛胚胎的低温储存

自20世纪70年代牛胚胎冷冻保存技术开始发展以来，胚胎的冷冻保存已成为胚胎移植的常规技术环节之一，20世纪90年代，冷冻胚胎的移植数量就已经占胚胎移植总数的80%。然而，行业里冷冻胚胎的移植妊娠率一直都低于鲜胚移植妊娠率，且常用于冷冻胚胎的液氮在存储过程中需不断补充，运输不便。因此，有必要研究在无液氮的情况下短期非冷冻保存胚胎的可行性，为牛胚胎移植提供一种更为简单、实惠且不需要特殊设备，适用于牧场条件下的胚胎短期储存方法。

日本的一项研究表明，鱼源性抗冻蛋白(AFP) 具有保护细胞及其细胞膜免受低温损伤的特殊能力，因此研发了一种具有该蛋白的培养基，可使牛胚胎在4℃下保存10天乃至更长时间。

AFP最初是从在冰雪环境中生存的鱼类的血液中分离出来的一种大分子物质，可以与冰晶结合，并防止冻结。根据氨基酸序列和三级结构，AFP可以分为抗冻蛋白AFP I-IV型和抗冻糖蛋白AFGP型。不同分型对细胞保护作用略有区隔，如AFP I-III型可在4℃下保护牛卵母细胞膜24小时，AFP I型可使绵羊胚胎在4℃下保存长达4天。我们选择了一种名为nfeAFP11 的AFP III型亚型，它是具有66个残基的单体多肽，初步表明其对胚胎保存具有卓越的保护能力。

科研人员首先进行了重组nfeAFP11的制备，并以日本黑牛为供体进行了体内胚胎的生产回收。为了评估nfeAFP11的效果，科研人员将优质牛胚胎(桑椹胚至囊胚阶段)转移到在石蜡油覆盖下的TCM199小滴内，并分别制作了含20-50% FBS以及是否添加nfeAFP11的TCM199小滴，在将胚胎装入麦管后对胚胎进行了低温保存。随后，160个优质日本黑牛体内胚被随机分组，统计低温储存240小时后胚胎的存活率和孵化率。结果显示，添加nfeAFP11的组胚胎存活率明显高于不含nfeAFP11的组(表1)。与其他实验组相比，加入nfeAFP11 的20% FBS组胚胎孵化率显著增加（P < 0.05）。

为了检查添加了nfeAFP11的冷冻胚胎的妊娠率，科研人员还以荷斯坦奶牛为受体，将在4-5℃下储存了240小时的4个体内胚进行了胚胎移植，该组冷冻胚胎的妊娠率为50%，且在妊娠30天和90天之间均没有观察到胚胎死亡。在妊娠285天左右，两只受体各分娩了一只活的和一只死产的小牛。小牛的出生体重分别为38.0 kg（下图，活产）和36.6 kg（死产），死产小牛未畸形。

通过超数排卵来获得胚胎是哺乳动物人工繁育的必要手段，其中最主要的因素是胚胎的生存能力，延长牛胚胎在低温环境下的存活时间将为牛胚胎移植带来更多便利，有利于群体遗传改良工作的推进。研究表明，使用含有AFP的培养基可将牛胚胎低温储存长达10天，为了更具实用价值，未来还可提供能够在低温下保存哺乳动物胚胎超过10天的方案，我们相信其他类型的AFP可能会更长时间地保持哺乳动物胚胎的活力。

参考文献：Atsushi IDETA, Yoshito AOYAGI, Kanami TSUCHIYA, Yuuki NAKAMURA, Kou HAYAMA,Atsushi SHIRASAWA, Kenichiro SAKAGUCHI, Naomi TOMINAGA, Yoshiyuki NISHIMIYA and Sakae TSUDA. Prolonging hypothermic storage (4 C) of bovine embryos with fish antifreeze protein, Journal of Reproduction and Development, 2015 ,Vol. 61, No 1.

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